實(shí)驗(yàn)中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

實(shí)驗(yàn)中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

親和層析法純化的二抗

用親和層析法純化的抗體是指，利用耦聯(lián)到瓊脂糖凝膠上的抗原將抗血清中的抗體親和層析下來(lái)。我們采用一種*的連續(xù)的洗脫過(guò)程將抗體從固態(tài)抗原上分離出來(lái)。我們提供的未標(biāo)記的親和層析法純化的抗體是不含有穩(wěn)定劑和防腐劑的無(wú)菌液體。耦聯(lián)標(biāo)記物的抗體是凍干粉，里面含有穩(wěn)定劑和防腐劑，但是過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體里面不含防腐劑。  

親和層析純化抗體的選擇和定位

*步： 選擇 Whole IgG 、 F(ab ’)2 片段，或者 Fab 片段抗體。 
我們提供三種親和純化的二抗： Whole IgG ， F(ab ’)2 片段， Fab 片段。  

Whole IgG 抗體是從抗血清中分離出來(lái)的完整的分子。這些抗體有一個(gè) Fc 部分和兩個(gè)與抗原結(jié)合的 Fab 部分，因此是二價(jià)的（圖 1 ）。它的平均分子量約為 160KD ， Whole IgG 抗體適用于多數(shù)情況，也是的。

F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分，剩下兩個(gè)靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的 Fab 部分，依然是二價(jià)的。（圖 1 ）這抗體用在特定的情況中，例如避免抗體與 Protain A 或 G 結(jié)合，或者與有 Fc 受體的活細(xì)胞結(jié)合。但是，如果一抗是 whole IgG ，不管二抗是哪種形式都可能出現(xiàn)結(jié)合 Fc 受體。這時(shí)，為了阻止抗體結(jié)合到 Fc 受體上，可以在 4 度將細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)于含有疊氮鈉和二抗來(lái)源物種正常血清的緩沖液中。

注意：當(dāng)使用的是帶標(biāo)記的二抗時(shí)，千萬(wàn)不能用一抗來(lái)源物種的正常血清和 IgG 來(lái)封閉。如果血清中的免疫球蛋白非特異性的結(jié)合到樣品上，他們會(huì)被帶有標(biāo)記的二抗識(shí)別，導(dǎo)致背景過(guò)高。

牛血清白蛋白（ BSA ）和奶粉是zui為常用的封閉液，它們可能含有 IgG, 除了牛抗羊 IgG 外，許多二抗如抗牛，抗山羊，抗綿羊與牛 IgG 有較強(qiáng)的反應(yīng)。因此，使用 BSA 或奶粉封閉或稀釋抗體會(huì)增加背景或降低抗體效價(jià)。推薦用來(lái)自二抗的物種的正常血清（ 5% v/v ）封閉。

 Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。這些抗體只含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖 1 ）。它們用來(lái)封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來(lái)源的一抗作多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中，用于封閉暴露的免疫球蛋白。而二價(jià)的抗體（ whole IgG 或 F （ ab’ ） 2 片段）不能用來(lái)封閉，因?yàn)樗鼈冇卸€(gè)結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，一些結(jié)合位點(diǎn)可能為暴露出來(lái)，與一抗結(jié)合，從而導(dǎo)致高的背景或假陽(yáng)性標(biāo)記。

第二步： 在左邊標(biāo)記“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來(lái)源。

抗體是根據(jù)一抗的物種來(lái)源的字母表順序排列。比如，如果一抗是小鼠來(lái)源的，就找“ anti-mouse ”。

說(shuō)明：目錄中提供了抗敘利亞倉(cāng)鼠和抗亞美尼亞倉(cāng)鼠的抗體。為了正確的選擇二抗，必須知道一抗是在哪種倉(cāng)鼠中制備的。

第三步： 在標(biāo)有“ Host ”這一欄中選擇二抗的物種來(lái)源。

二抗的物種來(lái)源在抗體描述的開(kāi)始部分，選擇二抗的物種來(lái)源應(yīng)考慮幾點(diǎn): 1) 個(gè)人的取向或經(jīng)驗(yàn)。 二抗的質(zhì)量問(wèn)題與物種特異性沒(méi)有關(guān)系。2 ）與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合。兔抗體能很好地與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合，但羊和猴抗體能更好的與蛋白G結(jié)合。 3 ）經(jīng)物種吸附處理的抗體可用性。某些物種來(lái)源的抗體可能不能被具有交叉反應(yīng)的物種進(jìn)行吸附處理。選擇經(jīng)過(guò)吸附處理的物種。4 ）物種兼容性。 在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，一些物種不能和其他物種兼容。一般地，多標(biāo)記二抗必須來(lái)自同一物種。

第四步： 在“ antibody description ” 下面選擇二抗的特異性。

下面詞語(yǔ)的解釋將對(duì)選擇合適的抗體有所幫助。

注意：不同來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗體的生成過(guò)程也相似。抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)， 除非特異性的經(jīng)過(guò)交叉反應(yīng)物種的吸附處理。在抗體描述中，經(jīng)過(guò)其他物種的吸附處理的抗體標(biāo)有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

Anti-IgG (H+L)

這類(lèi)抗體和 IgG 分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，比如，和 IgG 分子的 Fc ， F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族（ IgM ， IgA ，IgD,IgE ）和亞家族反應(yīng)，因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥加邢嗤妮p鏈（或者 κ 鏈，或者 λ 鏈）。 Anti-IgG (H+L) 抗體比只抗片段的抗體識(shí)別更多的抗原表位，適合普通的免疫檢查過(guò)程。

Anti-IgG ， Fc/ Fc γ fragment specific

這類(lèi)抗體和 IgG 重鏈的 Fc 部分反應(yīng)。它們通過(guò) ELISA 檢測(cè)，和 / 或針對(duì) Fab 片段吸附測(cè)試。某些情況下，這類(lèi)抗體需要額外檢測(cè)和 / 或吸收處理來(lái)降低 IgM 和 或 IgA 的交叉反應(yīng)。在這種情況下（ 抗人，抗鼠和抗大鼠 ），抗體標(biāo)有“抗IgG （ Fc γ ）”，表示這類(lèi)抗體只與 IgG 重鏈反應(yīng)，通常不能和 IgA 或 IgM 任何表位反應(yīng)。

注意：不是所有 anti-IgG, Fc 抗體和所有亞型的 IgG 反應(yīng)能力一致。要找和四種 IgG 亞類(lèi)反應(yīng)能力差不多的 抗鼠IgG, Fc γ抗體的話(huà)，應(yīng)當(dāng)選羊抗鼠IgG( 亞類(lèi)1+2a +2b+3), Fc γ特異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

Anti-IgG ， F(ab ’)2 fragment specific

這類(lèi)抗體和 IgG 的 F(ab ’)2/Fab 部分反應(yīng)。它們經(jīng)過(guò)了 ELISA 和 / 或 Fc 片段的吸附檢測(cè)。它們不是特異性 IgG ，因?yàn)樗鼈兪呛洼p鏈反應(yīng)的，它們同時(shí)也和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白（ Ig D, IgM, IgA 和IgE ）和亞類(lèi)反應(yīng)。

(min X …Sr Prot)

與一個(gè)物種反應(yīng)的二抗可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)其他物種的吸收實(shí)驗(yàn)。這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)了檢測(cè)，以及針對(duì) IgG 和圓括號(hào)中的物種的血清蛋白的吸附處理。 （標(biāo)有“ (min X…Prot)” 字樣的抗體是經(jīng)過(guò)了圓括號(hào)中所標(biāo)的物種的 IgG 和 / 或血清蛋白的吸附處理的）。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時(shí)，推薦使用這類(lèi)抗體。但是，當(dāng)要選擇經(jīng)過(guò)針對(duì)相近物種吸附處理的抗體時(shí)，要特別注意，因?yàn)樗鼈兡茏R(shí)別的表位數(shù)量大大減小了，可能識(shí)別單抗的能力很弱。例如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，只用經(jīng)大鼠 IgG 吸附處理的抗鼠 IgG 檢測(cè)大鼠組織中的鼠源一抗，或者在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用了大鼠的一抗。另個(gè)一個(gè)例子是抗大鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗敘利亞倉(cāng)鼠 IgG （ min X….Mouse, Rat Sr Prot ）。

實(shí)驗(yàn)中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

以下是圓括號(hào)中所使用的一些簡(jiǎn)稱(chēng)：

Bov = Bovine
      Ck = Chicken
      Gt = Goat
      GP = Guinea Pig
      Sy Hms = Syrian Hamster
      Hrs = Horse
      Hu = Human
      Ms = Mouse
      Rb = Rabbit
      Shp = Sheep
      Sw = Swine
      Sr = Serum
      Prot = Protein.

ML （ Multiple Labeling ）

有些抗體標(biāo)明了“ ML ” ，來(lái)強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo)，還可用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG 和抗敘利亞倉(cāng)鼠IgG

大部分倉(cāng)鼠單克隆抗體是來(lái)原于亞美尼亞倉(cāng)鼠的脾臟細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，它是亞美尼亞（而不是敘利亞）倉(cāng)鼠IgG. 許多商業(yè)化的多克隆抗倉(cāng)鼠IgG 是抗敘利亞倉(cāng)鼠IgG, 這種抗體在檢測(cè)亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG 單克隆抗體時(shí)，它的效果沒(méi)有抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG 好。

注意：抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識(shí)別所有的亞美尼亞倉(cāng)鼠單克隆抗體，因?yàn)樗?jīng)相近物種的吸附處理過(guò)（粗體字）。因此，使用經(jīng)過(guò)少數(shù)物種或少數(shù)相近物種的吸附處理過(guò)的抗體可達(dá)到較好的效果，如抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外，在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應(yīng)該檢測(cè)亞美尼亞倉(cāng)鼠單抗。

第五步： 從表格頂部選擇需要的探針。

關(guān)于探針的技術(shù)信息參考其他網(wǎng)頁(yè)。

第六步： 在 antibody description 一行和探針欄相交處，找到選擇的抗體的價(jià)錢(qián)、規(guī)格和目錄號(hào)。

每個(gè)方格頂部的數(shù)字是每單位的價(jià)錢(qián)，底部的 9 位數(shù)字為目錄號(hào)。

第七步： 以定購(gòu)目的查看產(chǎn)品說(shuō)明

為了避免錯(cuò)誤，產(chǎn)品說(shuō)明應(yīng)該遵循一個(gè)特定的語(yǔ)法排列。比如，目錄號(hào)為 115 － 096 － 072 的產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)描述為：

FITC-conjugated  |	AffiniPure |	F(ab)2 fragment  |	of Goat |	Anti-Mouse  |	IgG, F(ab)2 fragment specific  |
A	B	C	D	E	F
(minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins)  |
G

A.       耦聯(lián)的探針說(shuō)明，如熒光素，酶，生物素等。如果抗體沒(méi)有耦聯(lián)，不用寫(xiě)。

B .      抗體純化是商標(biāo)名字，是指從抗血清中通過(guò)偶聯(lián)瓊脂糖的抗原免疫層析的方法分離得到的抗體。

C ．抗體的形式－ 完整IgG, 或者 F(ab ’)2 、 Fab 片段。

D.      抗體來(lái)源物種名稱(chēng)。

E ．     和該抗體反應(yīng)的物種名稱(chēng)。

F.     抗體特異性描述。

G.      經(jīng)過(guò)吸附處理以后減小了交叉反應(yīng)的物種名稱(chēng)。  

實(shí)驗(yàn)中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

 

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